正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

CL（EC 3.2.1.4）存在于细菌、真菌和动物体内，能够催化纤维素降解，是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。

测定原理：

采用蒽酮比色法测定CL催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、浓硫酸和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体6mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体40mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存； 临用前加入5mL蒸馏水和45mL浓硫酸充分溶解待用。

样品测定的准备：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

分光光度计预热30min以上，调节波长至620nm，蒸馏水调零。

2、加样表（在EP管中依次加入下列试剂）：

试剂名称	对照管	测定管
样本	100	100
试剂一（μL ）		180
试剂二（μL ）	740	740
蒸馏水（μL ）	360	180

37℃振荡反应1h后，90℃水浴15min（盖紧，防止水分散失），冷却后

糖化液 (μL)	350	350
试剂三 (μL)	650	650

8000g 25℃离心10min，取上清，得糖化液

混匀， 90℃水浴10min（盖紧，防止水分散失），冷却，620nm处蒸馏水调零，测定吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。

CL活力计算：

1、标准条件下测定的回归方程为y = 5.018x - 0.0462；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、血清（浆）CL活力的计算

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V反总]÷V样÷T =39.8×(ΔA+0.0462)

3、细胞、细菌和组织中CL活力的计算

（1）按照蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V反总]÷(V样×Cpr) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL活力(μg /min /g鲜重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V反总]÷(W× V样÷V样总) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V反总]÷(500×V样÷V样总) ÷T

=0.0796×(ΔA+0.0462)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反总：反应体系总体积，1.2mL； V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。