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间充质干细胞培养

概述

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是成体干细胞家族的重要成员,来源于发育早期的中胚层和外胚层,属于成体干细胞。MSC最初在骨髓中发现,因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。如MSC在体内或体外特定的诱导条件下,具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质和心肌细胞分化能力,不仅如此,它还可以跨胚层分化为神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞等。经连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能,可作为理想的工具细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

1.直接培养法(全骨髓培养法)

1987年,Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞,而且这些细胞扩增20-30代后仍能保持其多向分化潜能,这类细胞即为骨髓间充质干细胞(BMSC),其工作对今后MSC的研究具有重要意义,不仅证实了骨髓MSC的存在,而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法,得到了广泛的应用。

培养大鼠MSC的实验步骤:

1.1接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞;

1.2原代培养24h48h各换液一次;

1.3观察细胞情况,在原代培养7天左右时,如观察到成片的典型形态的细胞,在瓶底用Marker笔标记,0.25%胰酶消化,镜下观察控制,约5-10分钟(室温太低时应放置到孵箱中),加入全培养基终止消化,瓶体朝上,吸管轻轻吹打4-8分钟,尤其是标记部位;

注意事项:不要用力吹打,以免把贴壁较牢的成纤维细胞,上皮样细胞吹打下来;

1.4传代到新瓶中,加入少量培养基,孵箱静置20-30分钟后,MSC大多牢固贴壁,瓶底朝上,轻轻吹打,丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞(大多是上皮样细胞),加入全培养基开始传代培养,如观察仍有较多杂细胞,可重复上述步骤;

1.5经上述处理后,原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长,可继续按原代培养,如观察到MSC的克隆,仍可按上述步骤纯化处理;

1.6原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞,可直接镜下瓶底标记后,超净台里用长吸管尖端机械刮除,吸出去掉。

2.密度梯度离心法

2.1用比重为1.073g/mlpercoll分离(400g×20min)人骨髓MSCs

2.2取界面处细胞层,离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种;

2.3 72h后更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每3d换液一次。细胞长到80%汇合时1:1传代。

注意事项:

1 MSC贴壁培养得到的细胞不均一,但是多能分化能力和增殖力好,percoll分离得到的细胞较为均一,多能分化性和增殖力不如贴壁培养的,尤其是增殖力相差很远,有人添加bFGF/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力;

2小鼠间充质干细胞原代培养一般14天左右,人间充质干细胞原代一般10天左右,即可传代。

间充质干细胞传代操作

1传代时先全部吸出培养液后,用无Ca2+ Mg2+PBS液洗涤二次;

2加入37℃预热的0.25%2.5g/L0.25%)胰蛋白酶消化1-2分钟;

3吸去胰酶,以残留的胰酶继续消化,倒置显微镜下观察,细胞开始皱缩时(细胞开始变圆)加入完全培养液终止胰酶作用;

4吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中,1500r/min 离心10分钟后弃上清,再用PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶;

5将细胞再悬浮于培养液中,按2-5×105/ml再次接种传代于新的培养瓶中。当这些细胞生长接近融合层时,即得到骨髓 MSC

间充质干细胞的冻存

1. 细胞消化和计数,用胰酶对待冻存的细胞进行消化,并对细胞进行计数。

2. 1000/min离心5分钟(4℃),去掉上清;

3. 根据细胞计数的情况,加入适量的干细胞冻存液,使细胞密度在1×106左右(或根据自己希望达到的细胞密度);

4. 轻轻地重悬细胞(务必重悬均匀);

5. 将重悬的细胞按等份加入到灭菌的冻存(需提前做好标记或者贴上标签)中,旋紧冻存管盖;

6. 将冻存管放入冻存盒中,然后将冻存盒直接放入-80℃;

7. 第二天将细胞从-80℃转移到液氮中。

间充质干细胞的鉴定

不同来源的间充质干细胞表面标记有所不同。MSC一般表达CD73 CD90 CD105MSC一般不表达CD14CD29CD34CD45CD44CD71CD106CD120aCD124CD166HLA class II等表面蛋白。

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