概述

人胚胎干细胞 (human embryonic stem cell , hESC) 是由受精4-5天的囊胚内细胞团 (inner cell mass, ICM) 分离出来的具有发育多能性、在体外可无限增殖的细胞系。Thomson等首次成功建立了5株 hESC细胞系, 并在体外培养成功。
诱导性多能干细胞（induced plutipotent stem cell,iPSC），是通过导入外源性基因，将体细胞逆转而成的多能性细胞，具有与胚胎干细胞类似的多能性。2006，日本科学家Yamanaka首先建立小鼠诱导性多能干细胞（miPSC），随后又于2007年与美国的Thomson实验室同时成功建立人诱导性多能干细胞（hiPSC）。Yamanaka也因此项研究荣获2012年诺贝尔生理与医学奖。
hESC与hiPSC都具有分化成为三胚层的多向分化潜能。据已发表的文献报道，可以分化成多种细胞，比如神经元、心肌细胞、胰岛beta细胞、血细胞和生殖细胞等，蕴涵着巨大的临床应用潜力。近期，由于研究人员与临床医生的共同努力，hESC与hiPSC成功实现了从科研到临床应用的转化。2011年，美国先进细胞技术公司获得美国食品和药物管理局（FDA）批准使用hESC治疗老年性黄斑病变引起的失明，并取得显著的效果；2013年，日本批准其理化研究所使用人诱导性多能干细胞（hiPSC）治疗老年性黄斑病变引起的失明，亦取得显著的疗效。此两项研究展示了hESC/hiPSC显著的疾病治疗作用，开创了多能干细胞临床治疗应用的新纪元。

加饲养层细胞培养法-准备饲养层细胞

1.1 加入足量的基质胶均匀铺到瓶（或孔板或皿）底部，以能覆盖全部底部为准， 譬如6孔板培养瓶以超过 0.3ml 为宜。
1.2  37℃培养箱放置至少30min。
1.3 从培养箱中取出培养板（或瓶或皿），轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再次覆盖，然后立即吸弃基质胶。
1.4 加入适量成纤维细胞完全培养基（37℃预孵育超过 10min），譬如6孔板以加入 2ml 为宜。
1.5 从液氮中取出冻存的失活过的 MEF 细胞，立即投入 37℃水浴中，迅速解冻 （1min之内）。
1.6 根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的孔板（或瓶或皿） 中，混匀。推荐的饲养层细胞密度为3 万cells/cm²
注意事项：
• 饲养层细胞需在ES/iPS细胞传代前两至三天准备；
• 饲养层细胞的密度最适宜是80－90％, 太密或是太稀疏都容易使干细胞分化；
• 饲养层细胞铺了10天之后推荐不再使用。

复苏

2.1 解冻人ES/iPS细胞，从液氮中取出冰冻的人类 ES/iPS 细胞冻存管，立即投 入 37℃水浴中快速的旋转以迅速解冻（控制在 1min 之内）；
2.2 当只有一片冰晶存在时，从水中取出冻存管。用酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍，以去除水缸中的微生物；
2.3 将细胞转移到一个预装有 2ml 人胚胎干细胞培养基的15ml 离心管中，混匀， 200× g（1000rpm）, 离心3分钟；
2.4 吸弃上清液，用1ml 的人胚胎干细胞培养基重悬细胞沉淀；
2.5 转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞6孔板的1孔中，补加人胚胎干细胞培养基至总体积为2ml；
2.6 将瓶放入37℃的CO2 培养箱中，观察细胞每天的生长情况。
注意事项
• 复苏的第二天无需更换培养液，从第三天起每天更换新鲜的人胚胎干细胞培养基；
• 复苏后第 4 天左右可以看见微小的克隆出现，之后逐渐长大；
• 复苏后第 10天左右传代，具体情况视 ES/iPS 细胞生长情况而定。

传代（以 6孔板为例）

3.1 从培养瓶中吸出旧的人胚胎干细胞培养液；
3.2 立即加入1ml 37℃预热的Ⅳ型胶原酶到瓶中，温柔的摇晃培养瓶使之覆盖到所有的细胞；
3.3 将培养板重新放回37℃培养箱中，放置约20min－30min； 
3.4 消化期间，吸弃饲养层细胞里面的成纤维细胞完全培养基，然后加入4-5ml 新的人胚胎干细胞培养基，以备传代；
3.5 待克隆消化下来后，取出培养瓶，将瓶中液体连同脱落的克隆转移到 15ml
离心管里，加入2ml的人类胚胎干细胞培养液，混匀；
3.6 待干细胞团块沉降下来后，吸弃上清液；
3.7 加入 2ml 新鲜的人类胚胎干细胞培养液，待细胞沉降下来后，吸弃上清；
3.8 加入 2ml 新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞，并用移液枪吹打克隆到适合大小，然后根据自己需要按比例传代，传代比例通常为 1：6或1：8。
注意事项：
• 在消化过程中，最好每隔 10min 拿出来观察一下，看是否已经开始消化。随着克隆的消化，克隆边缘部分卷起，轻轻晃细胞就会脱落时，表明消化充分。注意：消化时间约为 20－30min，根据经验，这一时间段可以将未分化的干细胞克隆消化下来，而分化的克隆就不会消化下来，所以，消化时间不宜过长，这样可以剔除分化的克隆。而如果消化不充分，会导致传代后的细胞结块。所以，要掌握好时间；
• 如果细胞不易沉降，则可以 300g离心30sec－1min使细胞沉降；
• 传代后的第一天，不需更换新的培养液，从第二天起，每天换液；
• 传代的前两至三天预铺 feeder；

冻存（以 6孔板为例）

4.1 当细胞生长良好时，消化细胞（具体步骤同上述传代过程）。
4.2 将消化下的细胞洗涤两次。
4.3 用1ml新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞并吹打至传代大小。
4.4 待克隆沉降下来后，吸弃上清。
4.5 加入0.5ml人胚胎干细胞冻存液，快速混匀。
4.6 将上述0.5ml细胞悬液转移至2ml冻存管中。
4.7 迅速将冻存管放入冻存盒中，-80℃冰箱过夜。
4.8 最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。

无饲养层细胞培养-Accutase细胞分离液传代的操作

1.1 将胚胎干细胞完全培养基取出并放置至室温， 37℃水浴预热Accutase细胞分离液。
1.2 将Matrigel加入培养皿/瓶，使之完全覆盖皿/瓶底，置于5% CO₂的37℃恒温细胞培养箱中至少30分钟。
1.3 吸走旧的胚胎干细胞完全培养基，加入Accutase细胞分离液使之完全覆盖皿/瓶底。
1.4 室温孵育3-5分钟，显微镜下观察到大部分克隆边缘卷起，克隆内部大部分细胞间出现间隙但尚未相互分离，肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白，表明细胞消化时间理想。
1.5 吸去Accutase细胞分离液，细胞刮刀将细胞刮下，沿壁缓慢加入适量胚胎干细胞完全培养基重悬，移液器或移液枪将重悬液移入离心管中，室温放置5分钟左右，使克隆团块自由沉淀，吸去培养基。
1.6 加入新鲜的胚胎干细胞完全培养基，并加入终浓度为10ng/ml的Y27632，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液。
注：吹吸的力度要轻柔，吹吸混匀的次数总共不超过3次为宜。吹打过度导致大量单细胞出现是造成细胞分化或死亡的重要原因。
1.7 将包被Matrigel的培养皿/瓶从培养箱中取出，弃去多余的Matrigel，将干细胞以10%的密度接种到培养皿/瓶中，调节培养液体积至合适的量。
1.8 显微镜下观察细胞呈4-20个细胞大小的团块，水平十字振动使细胞均匀分布，将细胞置于5% CO₂的37℃恒温培养箱培养。
1.9 1-2h后，待细胞团块贴壁后，弃去含Y27632的旧液，加入新鲜胚胎干细胞，置于5% CO₂的37℃恒温培养箱继续培养。
1.10每天换液直至达到可以传代的标准。
注意事项：
• 通常早代次(<10代)的干细胞需要以较低的比例传代，如1:2-1:3；成功建系的干细胞（10代以上）可以1:5-1:10的比例传代，传代的比例由细胞株的生长速率决定。
• 比较理想的传代时间间隔是3-5天一次，复苏的细胞第一次传代时间一般是复苏后第6天。