脂质体转染

脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2,3-Dioleyoxy,Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

脂质体转染原理

脂质体转染方法原理：阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA-脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体 其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。

脂质体转染操作步骤

操作步骤[方法一]：

细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。

转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。

转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

快速脂质体转染法 [方法二]：

以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。

在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：

在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。

弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。

再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时。

吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。

用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

稳定的脂质体转染方法：

接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。

DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。

在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。

吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。

Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细胞方法如下：

转染前1天将0.5～2×105细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95%。

准备复合物

将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。

将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中，轻轻浑匀，室温孵育5分。

5分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分。

吸去培养板的培养基，用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次。

将复合物(总体积100ul)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。

将细胞放入培养箱孵育4～6h后，可以更换含血清培养液去除复合物(也可不用)。

24～48h后可以观察转入基因表达情况。

稳定转染：换含血清培养基24h后将细胞以1：10(或更高比例)传代，1天后更换筛选培养基筛选。

优化：要保证细胞汇合率达90～95%(比较高)；DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般细胞1：2～3。