定点突变技术

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。

定点突变技术原理

普通的定点突变试剂盒通常是基于反向PCR技术，采用高保真耐热DNA聚合酶和互补的突变引物向目的基因引入单个碱基或多个邻近碱基的突变、缺失、或插入。PrimeMut XL Site−directed Mutagenesis Kit是依科赛隆重推出的明星分子生物学产品，该产品不但具有普通定点突变试剂盒的功能， 而且当遇到多个位点突变的需求时， 也可以实现一步多点突变，最多可引入5个位点的突变， 解决了普通单点突变试剂盒只能对目标位点逐一引入突变，耗时费力的问题。

定点突变操作步骤

引物设计：

在所突变的碱基前后需要各保留15~20个与模板互补的碱基。

多个突变引物的设计必须以质粒的同一条链为模板，向同一个方向延伸。

如果两个或两个以上的引物在同一个反应中的时候，它们突变点位点之间的距离需在60 bp以上。如果两个引物之间距离在60 bp之内，就需要进行两个反应进行PCR。如果有5个以上的突变位点，应当进行两个PCR反应。

引物的3'端应包含至少一个G或C碱基，尽量避免三个以上的重复碱基。

尽量将引物的GC含量控制在40~60％。

模板准备：

请使用15 kb以下的质粒作为模板；如果模板质粒过大，可将所需突变的序列亚克隆到较小的载体中，完成突变后再克隆到目的载体中。

对于非甲基化的质粒(例如从大肠杆菌JM110或SCS110菌株中提取的质粒)，可通过转化dam＋ 的大肠杆菌菌株(如DH5α、TOP10、JM109、XL1−Blue等)，再抽提获得甲基化的质粒作为PCR反应模板。

尽量采用高纯度的模板质粒，浓度调整为50~100 ng/μl。

PCR扩增反应

37℃，Dpn I消化5 分钟，

转化、培养

鉴定阳性克隆