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酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay),简称ELISA

  • 检测原理

酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay),简称ELISA,是用于检测体液等多种生物样本中微量物质的固相免疫测定方法。它是一种特殊的试剂分析方法,是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型免疫测定技术,最初是1971年由瑞典学者Engvail和Perlmann,以及荷兰学者Van Weerman和Schuurs报道的一项新成果。ELISA技术自1970年代问世以来发展十分迅速,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域,成为分析化学领域中的前沿课题 。
ELISA检测的基础是抗原或抗体的固相化以及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。测定时,受检标本(测定其中的抗原或抗体)与固相载体表面的抗体或抗原发生反应;用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开;再加入酶标记的抗体或抗原,也通过反应而结合在固相载体上;此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例;加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。ELISA检测方法将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来,具有特异性强、灵敏度高的特点。

  • 检测方法

在实际应用中,通过不同的设计,具体的方法可有多种,比较常用的是ELISA双抗体夹心法和ELISA间接法。
本产品主要用于检测细胞因子等小分子,采用的是ELISA双抗体夹心法。检测原理:选择识别同一细胞因子不同抗原表位的抗体对(两个单抗),其中一个抗体作为捕获抗体包被在酶标板上,与标准品及待测样本中的细胞因子结合;另一个抗体标记生物素作为检测抗体,与结合在第一抗体上的细胞因子结合;然后再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素,亲和素与检测抗体标记的生物素结合;加入显色剂后,标记在亲和素上的HRP使无色的显色剂变蓝;加入终止液变黄,在450nm处测OD值。待测样本中的细胞因子浓度与OD值呈正相关。(检测原理示意图如下所示)

 

  • 操作步骤

1. 从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条,未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内封存于4℃。
2. 留空白孔(若使用双波长读板,空白孔可以不设)。
3. 分别将标本或不同浓度标准品(0 pg/mL孔加试剂稀释液)加入相应孔中(100 uL/孔),用封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱孵育90分钟。
4. 提前30分钟制备生物素化抗体工作液。
5. 洗板5次。
6. 除空白孔外,加入生物素化抗体工作液(100 uL/孔)。用封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱孵育60分钟。
7. 提前30分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置。
8. 洗板5次。
9. 除空白孔外,加入酶结合物工作液(100 uL/孔)。用封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱,避光孵育30分钟。
10. 洗板5次。
11. 加入显色底物(包括空白孔)100 uL/孔,37℃孵箱,避光孵育15分钟。
12. 加入终止液(包括空白孔)100 uL/孔,混匀后即刻测量OD450值(10分钟内)。

  • 结果判断

1. 每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。(若不减零孔值,标准曲线的零孔应相交于Y轴)。
2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
3. 若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。
http://www.excellbio.com/files/images/201501/201501120417110243.jpg

注意:本图仅供参考,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

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