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分子克隆常见问题

分子克隆常见问题

 

大质粒 >5kb 质粒模板)突变阳性率过低怎么办?

可能的原因有下面几个:

模板质粒用量太少:建议使用 100~150 ng 模板。

模板结构复杂:建议在 25μL的反应体系中加入 0-0.75μL PrimeSolution。一般加入 0.75μL PrimeSolution 25μL中可以达到满意结果, 但有些长模板质粒可能需要加入1.5μL左右才能达到预期结果。

模板和引物浓度不匹配:需要优化模板和引物的加入量。

 

定点突变没有或只长了极少量菌落是什么原因?

主要有下面3种可能:

PCR 反应失败:PrimeMut dNTPs失效; 尽量避免PrimeMut dNTPs的反复冻融,建议把PrimeMut dNTPs 分装成小份冻存于−20℃;请不要用传统dNTPs替代PrimeMut dNTPs;模板质量也很重要,使用高纯度的质粒DNA作为模板,电泳检测质粒完整性和浓度;可将95℃预变性时间延长为4min,退火时间延长至50~60 sec

转化失败:使用转化效率为108 cfu/μg DNA的感受态细胞;把DpnI消化后的产物进行乙醇沉淀纯化,尽可能把这些产物多加到感受态细胞中;如果使用了矿物油,应尽量使用尖、细的枪头,伸入到矿物油下方吸取反应液。

抗生素用错或浓度过高:使用适当浓度的抗生素琼脂糖平板。

 

挑克隆检测发现突变阳性率过低,怎么办?

有下面几种原因和对应的解决方法:

Dpn I消化效果不佳:加入Dpn I后应混匀并短暂离心并/或适当延长消化时间。

模板质粒用量不合适:建议使用50~100 ng模板。

引物降解失效:引物应适量分装,−20℃保存,避免反复冻融。

菌株使用不当:请确认使用提取的质粒的菌株为dam + 如果使用了dam− 的菌株(比如JM110SCS100),这些菌株缺少甲基化能力,它们产生的质粒不能被DpnI消化。

 

测序发现突变位点与预期不符是什么原因?如何解决?

可以从下面几个方面着手改进:

引物设计不理想:重新设计引物;提高退火温度。

合成的引物质量较差或纯度不够:仅通过脱盐处理的引物突变效率偏低,请选择可信赖的引物供应商, 使用 PAGE HPLC 纯化级别的引物。

 

转化后菌落长得很多是什么原因?

可能有如下几个原因:

Dpn I消化不完全:加入Dpn I后应混匀并短暂离心;适当延长消化时间。

未加抗生素或抗生素浓度过低:使用适当浓度的抗生素琼脂糖平板。

转化的模板过多:转化时加入 1-2μL模板。

 

qRT-PCR为什么无Ct值(信号)出现?

可能的原因如下:

反应循环数不够:一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45循环), 但高于45个循环会增加过多的背景信号。

检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。

模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况发生。

目的基因在组织中不表达或者表达量低:尝试其它组织。

 

为什么Ct值出现过晚?

可以尝试从下面几点查找:

反应条件不佳:设计更好的引物或探针;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。

PCR各种反应成分的降解或加样量的不足:更换PCR各种反应成分或增加上样量。

扩增产物片段过长:建议采用100-200bp的扩增长度。

为什么阴性对照也出现明显的扩增?

阴性对照也有扩增,需要从下面几个方面排查原因:

荧光PCR mix或水被污染:更换PCR mix或水。

模板结构复杂:仅通过脱盐处理的引物突变效率偏低,请选择可信赖的引物供应商, 使用 PAGE HPLC 纯化级别的引物。

模板和引物浓度不匹配:在35个循环后阴性出现扩增属正常情况,可配合溶解曲线进行分析。

反应过程中探针出现降解:用PAGE电泳对探针进行检测。

 

溶解曲线不止一个主峰,什么原因?

有下面几种可能:

引物设计不理想:避免引物二聚体和发夹结构的出现。

引物浓度不佳:适当降低引物的浓度。

退火温度低:适当提高退火温度。

镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度。

模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的污染,在RNA提取过程中使用DNaseI去除RNA中混有的基因组DNA

 

实验重复性不好是什么原因?

有下面几种可能:

加样不准确:使用预混液;尽可能少换枪头;反应液混匀。

模板浓度低:样品初始浓度越低,重复性越差,应减少样品的稀释倍数。

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